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凯氏定氮仪简介及其技术参数对比分析

发布来源:上海祗美电子科技有限公司  发布日期: 2022-04-25  访问量:243

概述

凯氏定氮仪是一种根据蛋白质中氮含量恒定的原理,通过测量样品中氮含量来计算蛋白质含量的仪器。由于其蛋白质含量的测量和计算方法称为凯氏定氮法,因此被称为凯氏定氮仪,又称定氮仪、蛋白质测量仪和粗蛋白测量仪。

凯氏定氮法原理图

原理

将有机化合物与硫酸共热,将氮转化为硫酸铵。在这一步中,硫酸钾经常被添加到混合物中,以增加中间产品的沸点。很容易判断样本分析过程的终点,因为混合物会变得无色和透明(一开始很暗)

在得到的溶液中加入少量氢氧化钠,然后蒸馏。这一步会将铵盐转化成氨。而总氨量(由样本的含氮量直接决定)会由反滴定法确定:冷凝管的末端会浸在硼酸溶液中。氨会和酸反应,而过量的酸则会在甲基橙的指示下用碳酸钠滴定。滴定所得的结果乘以特定的转换因子就可以得到结果。

适用范围

凯氏定氮仪器用凯氏方法检测谷物、食品、饲料、水、土壤、淤泥、沉淀物和化学物质中的氨、蛋白氮、酚、挥发性脂肪酸、氰化物、二氧化硫、乙醇等含量。性价比相当好,只需要人工操作,非常适合实验室和检验机构的常规检测。广泛应用于食品、作物、种子、土壤、肥料等样品的氮含量或蛋白质含量分析。

使用步骤

消化

1、准备6个凯氏烧瓶,标签。在1、2、3号烧瓶中加入适当浓度的蛋白溶液1.0mL,样品应加到烧瓶底部,不要碰到瓶口和瓶颈。依次加入硫酸钾-硫酸铜接触剂0.3g,浓硫酸2.0mL,30%过氧化氢1.0mL。4、5、6燃烧瓶作为空白对照,用于测量试剂中可能含有的微量氮物质,并校正样品测量。在4、5、6号燃烧瓶中加入蒸馏水1.0mL更换样品,其余试剂与1、2、3号烧瓶相同。2、将加入试剂的烧瓶放在消化架上,并连接抽气装置。首先用微火加热煮沸。此时,烧瓶中的物质炭化变黑,产生大量泡沫。一定要注意防止气泡冲出管口。当泡沫消失并停止时,增加火力,保持瓶内液体微沸,直到溶液澄清,然后继续加热,使消化液微沸15min。燃烧瓶在消化过程中应随时旋转,使粘在内壁的物质流入底部,以确保样品完全消化。消化过程中释放的气体含有SO2,具有强烈 性,所以自始至终打开泵,将气体泵入自来水排出。整个消化过程应在通风柜中进行。消化完全后,关闭火焰,将烧瓶冷却到室温。

蒸馏吸收

在微量凯氏定氮仪中进行蒸馏和吸收。凯氏定氮蒸馏装置种类繁多,一般由蒸汽发生、氨蒸馏和氨吸收三部分组成。

1、仪器的洗涤

仪器安装前,各部件应通过一般方法清洗,所用橡胶管和塞必须浸泡10%NaOH在溶液中,煮约10min,水洗、水煮10min,再洗几次,然后安装并固定在铁架上。在使用仪器之前,所有微量管道都必须用水蒸气清洗,以去除管道中可能残留的氨。在使用的仪器在每次样品前用蒸汽清洗5min可以。对于长期未使用的仪器,重复蒸汽清洗不得少于三次,并检查仪器是否正常。仔细检查每个连接处,确保无泄漏。首先,在蒸汽发生器中加入大约2/3的蒸馏水,加入几滴硫酸以保持酸性,以避免水中氨的蒸发,并加入少量沸石(或毛细管等),以防止沸腾。沿着小玻璃壁加入蒸馏水20mL让水通过插管流入反应室,但玻璃中的水不应抛光,塞上棒状玻璃塞,保持水密封,防止漏气。蒸汽发生后,立即关闭废液排放管上的开关,使蒸汽只能进入反应室,导致反应室内的水迅速沸腾。蒸汽通过反应室上端口的固定氮球进入冷凝管冷却,并在冷凝管下端放置锥形瓶接收冷凝水。从固定氮球热开始,连续蒸煮5min,然后拆下煤气灯。清洗后,夹紧蒸汽发生器与收集器之间的橡胶管。由于气体冷却压力降低,反应室内废液自动抽入反应室外壳,打开废液出口夹释放废液。这样清洗2~3第二,在冷凝管下更换一个含硼酸的-指示混合物的锥形瓶将冷凝管的下口完全浸泡在溶液中,蒸馏1~2min,观察锥形瓶中的溶液是否变色。如果不变色,说明蒸馏装置已经清洗干净了。取出锥形瓶,蒸馏1~2min,用蒸馏水冲洗冷凝器下口,关闭煤气灯,测量样品。

2、无机氮标准样品的蒸馏吸收

由于固定氮操作繁琐,为了熟悉蒸馏和滴定的操作技术,初学者应首先使用无机氮标准样品进行反复练习,然后测量有机氮未知样品。已知浓度的标准硫酸铵通常三次。取干净的100mL五个锥形瓶依次加入2%硼酸溶液20mL,次甲基蓝-甲基红混合指示剂(紫红色)3~4滴水,盖上瓶口备用。取其中一个锥形瓶在冷凝管的下端,并将冷凝管的出口浸泡在溶液中。注:在此操作前,必须打开收集器活塞,以避免锥形瓶中的液体反吸。准确吸收2mL将硫酸铵标准液加入玻璃中,小心提起棒状玻璃塞,使硫酸铵溶液慢慢流入蒸馏瓶,用少量蒸馏水冲洗小玻璃3次,放入蒸馏瓶中。然后将10 添加到小玻璃中mL 30%NaOH溶液使碱液慢慢流入蒸馏瓶,并在碱液完全流入之前盖住棒状玻璃。在小玻璃上加入5mL蒸馏水,然后慢慢打开玻璃塞,使一半的水流入蒸馏瓶,一半留在小玻璃中作为水封。关闭收集器活塞,加热蒸汽发生器进行蒸馏。锥形瓶中的硼酸-指示剂混合液由于吸收了氨,从紫色到绿色。从变色开始,再蒸馏3~5min,移动锥形瓶使瓶内液面离开冷凝管下口lcm,用少量蒸馏水冲洗冷凝管下口,然后继续蒸馏1min,取下锥形瓶,盖上,准备滴下来。蒸馏后,取下煤气灯,夹住蒸汽发生器与收集器之间的橡胶管,排除反应后的废液,用水冲洗小玻璃几次,排除废液。反复冲洗后,可以蒸馏下一个样品。用标准硫酸铵按上述方法再做两次。2mL用标准硫酸铵代替蒸馏水进行空白测定二次。将每次蒸馏的锥形瓶滴在一起。

3、未知样品和空白的蒸馏吸收

三个消化好的蛋白质样品,三个空白对照液,依次蒸馏吸收。5mL将热蒸馏水加入消化好的样品或空白对照液中,通过小玻璃加入反应室,然后用热蒸馏水清洗小玻璃3次,每次用水量约3mL,洗涤液倒入反应室。其余操作按标准硫酸铵蒸馏进行。由于消化液中硫酸钾浓度高且粘稠,不易从凯氏烧瓶中倒出。必须加入热蒸馏水5 mL稀释后,如果有结晶沉淀,必须微热溶解,趁热加入玻璃,使其流入反应室。此外,在仪器清洗不完全冷却时,应注意立即添加样品或空白对照液,否则消化液容易通过冷却管沉淀结晶,造成堵塞。

滴定

样品和空白蒸馏后,一起滴定。打开接受瓶盖,用酸微量滴定管0.0100mol/L滴定标准盐酸溶液。滴入瓶内溶液为深灰色时,用蒸馏水将锥形瓶内壁淋洗一次。如果振动后再次出现绿色,应小心滴入标准盐酸溶液半滴。振动观察瓶内溶液颜色的变化。深灰色在一两分钟内保持不变,视为到达滴定终点。如果是粉红色,则表示已超过滴定终点,可在滴定消耗的标准盐酸溶液量中减去0.02mL,每组样品的固定氮终点颜色必须完全一致。空白控制液接受瓶内溶液颜色不变或略有变化,未出现绿色,不得滴定。记录每次滴定消耗的标准盐酸溶液毫升数,供计算。

缺陷

从凯氏定氮的原理可以看出,凯氏定氮法是将含氮有机物转化为无机氮硫酸铵进行检测,以获得含氮量的测定值乘以一定系数来获得蛋白质含量。含氮有机物不仅是蛋白质,还有三聚氰胺等。此外,现行国家标准和食品中蛋白质含量的国际通用测定方法是经典的凯氏定氮法,为造假者提供了机会。蛋白质中的氮含量不超过30%。三聚氰胺较大的特点是氮含量高(66%),溶于水后无色无味。也就是说,在一杯清水中加入三聚氰胺,然后用凯氏定氮法进行检测。结果表明,它含有蛋白质。由于凯氏定氮法只能测量氮含量,不能确定饲料中是否有非法化学物质,理论上可以测量添加三聚氰胺的奶粉中蛋白质含量较高。

应用

凯氏定氮法的普遍适用性、准确性和可重复性已得到国际广泛认可。它已被确定为检测食品中蛋白质含量的标准方法。然而,这种方法并不能给出真正的蛋白质含量,因为确定的氮可能不仅仅是由蛋白质转化而来的。这可以反映在2007年美国宠物食品污染事件和2008年中国毒奶粉事件中:三聚氰胺,一种高氮含量,添加到食品中伪造高氮含量。此外,由于氨基酸序列不同,该方法还需要许多不同的校正因素。此外,凯氏定氮法还需要使用浓硫酸和长时间加热(一般超过1小时)。这也导致了杜马斯法有时在粗略测量蛋白质含量时更方便。

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